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層析分離管使用注意事項

                       層析分離管的平衡

新的層析分離管在經過出廠測試後都會保存在特定的溶劑中, 然而, 由於層析分離管在儲存或運輸過程中固定相可能會乾掉, 從而引起鍵結的空間結搆變化.

因此, 新的層析分離管在用來分析樣品之前需要達到充分的平衡.

逆相層析分離管的平衡方法

以純乙腈或甲醇作為移動相, 用低流速, 0.2mL/min將層析分離管平衡過夜(注意:斷開偵檢器), 然後, 提高流速, 0.8mL/min沖洗30min以便

將層析分離管填充物充分平衡最佳情況, 平衡過程中, 將流速緩慢地提高直至獲得穩定的基線, 如此, 延長層析分離管的使用壽命, 以及在以後的使用中得分析結果的再現性.

如果您所分析樣品使用到含有緩衝鹽類的移動相, 應注意先用20倍分離管體積以上的緩衝鹽類的水相--有機相進行過渡, 然後才更分析樣品的移動相, 直至得到穩定的基線.

正相層析分離管平衡方法

矽膠分離管或極性層析分離管需要更長的時間來平衡. 這些層析分離管在出廠測試後是保存在正庚烷(或正己烷)等非極性溶劑中, 如果極性層析分離管需要使用含水的移動相, 請在使用移動相之前用乙醇或異丙醇平衡.

當使用乙醇, 異丙醇, 乙酸粘度大的移動相時, 請使用低流速平衡, 同時平衡時間要延長, 甚至要加倍.

如果使用了保護分離管, 請將保護分離管和分析分離管一起平衡.

如果所用移動相中含有緩衝鹽類或離子對試劑, 則需要較長的時間來平衡.

每天用足夠的時間來平衡層析分離管, 就會在處理樣品分離問題方面獲得最大的補償”, 而且您的層析分離管壽命也會變得更長.

層析分離管的維護

● 為了延長層析分離管的使用壽命, 應在分析分離管前連接一個小體積的保護分離管. 保護分離管內徑一般為2-3mm, 長不超過3cm, 填充與分析分離管相同的固定相. 保護分離管使用得當, 對分離無明顯影響.

● 在層析分離管使用過程中, 應避免突然變化的高壓沖擊, 這往往是由進樣閥緩慢轉動, 幫浦突然起動引起, 流速驟升驟降等原因引起.

● 對矽膠基質的鍵合固定相, 移動相的pH一般保持在2.57.0. pH的移動相會溶解矽膠, 而低PH值的移動相會使固定的鍵合相脫落.

● 使用水溶性移動相時, 為防止微生物繁殖引起分離管阻塞, 可加入0.01%的疊氮化鈉(Sodium azide), 以抑制微生物的繁殖.

● 進樣前, 樣品最好使用0.45um濾膜過濾或經固相萃取淨化.

層析分離管的清洗

被分析樣品包含許多化合物, 如無機鹽, 類脂, 脂肪, 腐殖酸, 疏水蛋白質以及其他生物化合物, 有些物質會或多或少的取代被分析成分而被滯留在分離管中, 但這種滯留是較弱的, 如無機鹽通常易從分離管中被水相沖滌出來.

樣品基質物質若被中等程度滯留, 可慢慢被沖滌, 以寬峰, 基線擾動或基線漂移的方式. 如果物質被強烈滯留, 那麼經過多次進樣後這些被吸附的化合物會積聚在層析分離管分離管頭, 這種情況在等度沖滌中經常會遇到.

如果被吸附的物質含量高足以覆蓋部分鍵合固定相表面, 成為一種“新”的固定相, 那麼會導致層析峰的滯留時間漂移並且導致拖尾峰形.

如果層析分離管被嚴重污染, 其背壓也會迅速增大, 可能超過幫浦的壓力, 使分析無法進行.

逆相矽膠鍵合相層析分離管的清洗

逆相矽膠鍵合相一般包括C18, C8, C4, 苯基等, 當用二元混合溶劑進行等強度沖滌時. 為移去污染物, 可用>=20個體積的強沖滌溶劑, 如甲醇, 乙腈或四氫呋喃來沖洗分離管. 如果原先的移動相中含緩衝鹽類溶液, 為防止有機溶劑造成的鹽析出阻塞管路, 應首先用>=20個分離管體積的不含緩沖鹽的水-有機相溶劑沖洗層析分離管, 然後再用強沖滌溶劑清洗分離管.

如果用強沖滌溶劑仍不能驅除污染物, 可以使用更強的溶劑或混合溶劑來沖滌. 當需用一系列的有機溶劑清洗層析分離管時, 應逐漸增加它們的沖滌強度, 並且確保溶劑之間的混溶性. 對典型的逆相矽膠分離管, 用於洗滌無緩衝鹽類的體系, 推薦使用以下有機溶劑清洗系統:

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%四氫呋喃.

清洗後, 按相反的順序沖洗層析分離管, 以返回到原始的移動相.

如果使用者懷疑層析分離管被嚴重的污染或阻塞, 可將二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxideDMSO)與水或二甲基甲醯胺(DimethylformamideDMF與水, 以各自50%的比例混合, 並且以低於0.5mL/min的流速通過層析分離管.

由於污染物聚集在層析分離管頭, 反方向沖洗會縮短污染物在分離管中遷移的距離;又因為層析分離管皆在高於操作壓力下填充的, 通常逆向液流不會擾動層析分離管床.

但如果層析分離管頂端過濾篩板的孔徑大於分離管底部過濾篩板的孔徑, 則固定相的微小粒子會在反方向沖洗過程通過篩板流出分離管, 而會在分離管中產生新的空間, 引起分離管床鬆動. 因此在反方向沖洗前, 應先確認分離管兩端過濾篩板孔徑一致.

除鹽:

對普通逆相C18鍵合相分離管, 為除去分離管中含有的緩衝鹽類類或水溶性物質時, 不應使用純水沖洗. 因為C18鍵合相像一條長鏈將矽膠黏結, 當有有機溶劑存在時, 其表面被移動相潤溼, C18長鏈完全展開, 像海水中的海藻一樣. 當純水或緩衝溶液通過時, C18鍵合相不能被浸潤, 鍵合相表面會塌陷, 從而將溶劑, 樣品分子或無機鹽分子包合在裏面. 此時僅用純水無法將包合物沖滌出, 應使用含5%有機溶劑的水溶液沖洗, 以清除無機鹽或水溶性物質.

蛋白污染:

如果需清洗矽膠鍵合固定相中的蛋白質殘留物, 必須使用和前述不同的程序. 如果生物材料血漿或血清樣品注入層析分離管, 在大多數情況下, 純有機溶劑(如乙腈或甲醇)不能溶解肽和蛋白質, 用它們清洗層析分離管是無效的. 然而, 有時使用有機溶劑與緩衝物, 酸或離子對試劑的混合物卻是有效的.

清洗逆相分離管中的蛋白質類物質, 可使用表1溶劑系統.

1: HPLC逆相分離管中清洗蛋白質類物質使用的清洗溶劑系統.

溶劑 組成
乙酸 1%水溶液
三氟乙酸  1%水溶液
0.1%三氟乙酸-正丙醇  40:60(較粘稠)
三乙胺(TEA-正丙醇  40:60(混合前用燐酸調ph=2.5
尿素或胍的水溶液 5-8mol/l(PH=6-8)
NaCl, Na3PO4, Na2SO4水溶液  0.5-1.0mol/l
二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxideDMSO)-水或二甲基甲醯胺(DimethylformamideDMF- 50:50

金屬污染:

有時清洗矽膠逆相固定相需使用特殊的技術, 如在早期矽膠鍵合相生產中, 使用高金屬氧化物含量的矽膠, 金屬離子會吸附在鍵合相表面, 此時可使用0.05mol/ EDTA沖洗, 將金屬離子螯合, 再用純水將可溶性螯合物洗掉.


正相矽膠鍵合相層析分離管的清洗

正相分離管一般包括矽膠分離管, 氰基分離管, 氨基分離管和二醇基分離管. 如果該類層析

分離管被污染, 可通過如下方法清洗:

1.每次清洗都用低流速起步, 當分離管壓力達到一定的穩定程度, 再增加流速.

2.先用10分離管體積不含其它添加劑的移動相中的弱溶劑, 如正己烷, 氯仿等反沖層析分離管.

3.再用20分離管體積的移動相中的強溶劑, 如二氯甲烷或異丙醇等, 反沖層析分離管.

4. 100%異丙醇的極性和正相沖滌能力足夠把正相分離管上的所有殘留物清洗掉.

如果異丙醇的清洗還不足以恢復層析性能, 表示層析分離管床有塌陷和空洞了, 用清洗的方法無法解決這個問題.

對於正相分離管, 出現滯留時間漂移等選擇性改變的一些層析症, 填料可能還是完好的, 主要原因可能是固定相的水分含量發生變化, 大部分溶劑都含有小部分的溶解水分(正己烷攝氏20水分含量是0.0111% w/w ), 正相層析分離管中水分含量隨時間的不同是導致選擇性變化的最普通的一個因素. 這就需要用含2.5% 二甲氧基丙烷(dimethoxypropane)和2.5% 冰醋酸的正己烷沖洗層析分離管30個分離管體積, 可以去除層析分離管中水分並且恢復層析分離管原來或所需要的選擇性.

常用HPLC層析分離管的分離管體積如表2所示

分離管尺寸(mm 4.6*250  4.6*150 3.0*150
分離管體積(mL       2.5       1.5     0.64
分離管尺寸(mm 2.1*150 4.6*50
分離管體積(mL       0.28  0.5

 

     
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